膝骨关节炎患者关节液中miR-140-3p表达可反映骨关节炎进程

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.35.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (35): 5277-5283.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.35.016

• 骨与关节临床实践 clinical practice of the bone and joint • 上一篇下一篇

膝骨关节炎患者关节液中miR-140-3p表达可反映骨关节炎进程

殷春明¹，潘晓华²

¹暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院，广东省深圳市 518020；²南方医科大学附属深圳宝安医院创伤外科及矫形骨科，广东省深圳市 518100

修回日期:2016-06-13 出版日期:2016-08-26 发布日期:2016-08-26
通讯作者: 潘晓华，博士，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学附属深圳宝安医院创伤外科及矫形骨科，广东省深圳市 518100
作者简介:殷春明，男，1988年生，江西省赣州市人，汉族，暨南大学第二临床医学院在读硕士，主要从事骨关节外科的基础与临床研究。
基金资助:
2013年深圳市科技计划立项项目(JCYJ20130402101926968)；2013年深圳市国际合作项目(GJHZ20130418150248986)

Expression of miR-140-3p in synovial fluid of knee osteoarthritis patients reflects the progression of osteoarthritis

Yin Chun-ming¹, Pan Xiao-hua²

¹Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics and Traumatology, BaoAn Hospital Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China

Revised:2016-06-13 Online:2016-08-26 Published:2016-08-26
Contact: Pan Xiao-hua, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics and Traumatology, BaoAn Hospital Affiliated to Southern Medical University, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China
About author:Yin Chun-ming, Studying for master’s degree, Second Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Supported by:
The Project of Science and Technology Department of Shenzhen City in 2013, No. JCYJ20130402101926968; the International Cooperation Project of Shenzhen City in 2013, No. GJHZ20130418150248986

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

关节软骨的营养：来源于滑液的渗透，关节软骨与关节滑液之间存在一定的物质交换。与血液和尿液相比，关节液成分及量的变化更能反映关节内组织病变的发生和发展。

miR-140-3p：其为pre-miR-140转录而来的单链小分子RNA，其不编码蛋白质，但可在转录后调控基因表达，影响蛋白质的翻译，参与机体各种重要的生理和病理过程。

摘要

背景：骨关节炎是一种与年龄相关，以关节软骨退变为特点的关节疾病。

目的：检测膝关节液中miR-140-3p的表达，明确其表达量是否与骨关节炎严重程度相关。

方法：共收集到健康志愿者、痛风性关节炎患者、类风湿性关节炎患者各10例，膝骨关节炎患者45例，其中骨关节炎早期、中期、晚期各15例。应用实时荧光定量PCR检测各组膝关节液中miR-140-3p的表达。

结果与结论：①骨关节炎组miR-140-3p的表达明显下调，非骨关节炎组与骨关节炎组间表达量差异有显著性意义(P < 0.05)，健康对照组、痛风性关节炎与类风湿性关节炎组间差异无显著性意义(P > 0.05)；②健康对照组miR-140-3p的表达量是骨关节炎组的11.4倍，随骨关节炎严重程度的增加miR-140-3p表达量呈相对减少的趋势；③进一步行Spearman等级相关分析显示：骨关节炎的严重程度与miR-140-3p的表达量均呈负相关；④结果表明，关节液中miR-140-3p的表达量可以在一定程度上反映骨关节炎病程的进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

ORCID: 0000-0003-3732-5119(潘晓华)

关键词: 骨科植入物, 关节植入物, 骨关节炎, 膝骨关节炎, miRNA, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, 关节液, 荧光定量PCR

Abstract:

BACKGROUND: Osteoarthritis is an age-related joint disease characterized by articular cartilage degeneration.

OBJECTIVE: To assess the expression of miR-140-3p in synovial fluid of knee osteoarthritis, and identify whether miR-140-3p levels in synovial fluid are correlated with disease severity.

METHODS: We collected 10 healthy volunteers, 10 patients with gouty arthritis, 10 patients with rheumatoid arthritis, and 45 patients with knee osteoarthritis (15 cases in early stage, 15 cases in middle stage and 15 cases in the late stage). Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect miR-140-3p expression in synovial fluid in each group.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Expression of miR-140-3p was significantly down-regulated in knee osteoarthritis group. Significant differences in miR-140-3p expression were detected between non-knee osteoarthritis group and knee osteoarthritis group (P < 0.05). No significant difference in miR-140-3p expression was determined among healthy control group, gouty arthritis group and rheumatoid arthritis group (P > 0.05). (2) The miR-140-3p expression in the healthy control group was 11.4 times that in the knee osteoarthritis group. The expression of miR-140-3p decreased with the increase of the severity of osteoarthritis. (3) Spearman rank correlation analysis suggested that the expression of miR-140-3p was negatively correlated with osteoarthritis severity. (4) Results suggest that the expression of miR-140-3p in synovial fluid can reflect the progression of knee osteoarthritis to a certain extent.

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Key words: Osteoarthritis, Knee, Synovial Fluid, MicroRNAs, Polymerase Chain Reaction, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

殷春明，潘晓华. 膝骨关节炎患者关节液中miR-140-3p表达可反映骨关节炎进程[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(35): 5277-5283.

Yin Chun-ming, Pan Xiao-hua. Expression of miR-140-3p in synovial fluid of knee osteoarthritis patients reflects the progression of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(35): 5277-5283.

图/表（结果） 7

2.1 受试者数量分析 共收集到10例健康志愿者、10例痛风性关节炎患者、10例类风湿关节炎患者、45例膝骨关节炎患者关节液，其中骨关节炎早期、中期、晚期各15例。各组研究对象的年龄、身高、体质量、体质量指数等情况见表2。

2.2 基线资料比较 经方差分析显示，身高、体质量及体质量指数在各组间差异无显著性意义(表3)，但年龄在各组间的差异有显著性意义(F=3.73，P=0.005)。

2.3 miR-140-3p在各组膝关节液中相对表达量的分析 在健康对照组，类风湿关节炎组，痛风性关节炎组及骨关节炎早、中、晚期组患者膝关节液中均能检测到miR-140-3p的表达，扩增曲线如图1，经正态分布检验(K-S检验)表明：miR-140-3p在各组膝关节液中的相对表达量2^-^??Ct均服从正态分布。

对健康对照组，类风湿关节炎组，痛风性关节炎组及骨关节炎早、中、晚期组患者膝关节液中miR-140-3p、miR-140-5p的相对表达量(表4)行Levene法方差齐性检验，结果显示各组方差不齐(Levene Statistic=13.4，P < 0.05)。

进一步对miR-140-3p在各组关节液中的相对表达量行Tamhane’s T2检验(表5)，结果显示：miR-140-3p表达量在健康对照组、痛风性关节炎组与类风湿关节炎组间差异无显著性意义(P > 0.05)；非骨关节炎组与骨关节炎组间相对表达量差异有显著性意义(P < 0.05)，且miR-140-3p在非骨关节炎组中的表达量是骨关节炎组的9.6倍，健康对照组的表达量是骨关节炎组的11.4倍。miR-140-3p在骨关节炎早期、中期、晚期组间相对表达量差异均有显著性意义(表5)，且随骨关节炎严重程度的增加miR-140-3p表达量呈相对减少的趋势(图2)。

将miR-140-3p在健康对照组，骨关节炎早、中、晚期组间的相对表达量进一步行Spearman等级相关分析，结果显示Spearman等级相关系数r=-0.87，P=0.00。按α=0.05水准，可以认为miR-140-3p的表达量与骨关节炎的严重程度间存在负相关关系。

2.4 miR-140-3p相对表达量与年龄的相关性分析 绘制miR-140-3p在健康对照组、膝骨关节炎早、中、晚期组中的相对表达量与年龄的散点图(图3)。由散点图可见，miR-140-3p在膝关节液中的相对表达量与年龄间并无明显的直线相关关系；将miR-140-3p在健康对照组、膝骨关节炎早、中、晚期组中相对表达量与年龄的相关性进一步行Pearson相关分析，结果显示：miR-140-3p与年龄的pearson相关系数r=-0.144，P=0.293，按α=0.05检验水准，可以认为miR-140-3p在各膝关节液中的相对表达量与年龄之间无直线相关关系。

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引言

骨关节炎是一种慢性退行性关节病变，其发病率随年龄的增长而增加，是一种中老年人常见的关节疾病。骨关节炎特征性的表现是软骨细胞基质合成不足、关节软骨退变、骨赘形成和滑膜病变^[1-3]。骨关节炎的发病机制涉及到机体内多种生理、病理的复杂过程，确切机制尚不清楚，其中关节软骨合成代谢和分解代谢功能的紊乱，以及细胞外基质的降解是促进骨关节炎进展的关键因素^[4]。miR-140可以直接作用于IGFBP-5、MMP13和ADAMTS5等基因^[5-7]，对软骨的稳态起调控作用。

miR-140由miR-140-3p和miR-140-5p组成，二者均由Pre-miR-140转录而来，但是它们却由不同的碱基序列组成，并且调控不同的靶基因^[8]。先前的研究认为，miR-140-5p主要调控与骨关节炎相关的靶基因，miR-140-5p在软骨细胞中可靶向作用于HADC4、IGFBP5、ADAMTS5、Smad3、CXCL12、BMP2等基因^[5-6^，^9-10]。miR-140-3p主要调控神经系统相关的靶基因如dynamin1及NF-κB等^[11-12]。新近的研究却显示miR-140-3p与miR-140-5p在骨关节炎软骨细胞中的表达均下调，且二者表达量之间也存在差异^[13]，在增殖的软骨细胞中miR-140-3p比miR-140-5p处于更高的表达水平^[14]，这就说明miR-140-3p也可能在骨关节炎发病进程中发挥重要作用。因此，进一步展开miR-140-3p的研究对揭示miR-140在骨关节炎发病进程中的作用具有重要意义。

关节软骨的营养来源于滑液的渗透，关节软骨与关节滑液之间存在一定的物质交换；与血液和尿液相比，关节液成分及量的变化更能反映关节内组织病变的发生和发展^[15-16]。虽然有研究证实miR-140-3p在骨关节炎患者关节软骨中表达下调^[13]，但miR-140-3p是否在骨关节炎患者膝关节液中表达仍属未知。因此，对骨关节炎患者关节液中miR-140-3p的表达进行检测，比较分析骨关节炎不同分期患者关节液中miR-140-3p表达的变化情况，明确miR-140-3p的表达量是否与骨关节炎严重程度相关，为骨关节炎的早期诊断和治疗提供依据。

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材料方法

1.1 设计 基因表达检测。

1.2 时间及地点 于2015年5月5日在深圳市人民医院完成。

1.3 对象 按照美国风湿病学会(ARA)制定的诊断标准，诊断为骨关节炎患者45例^[17]。通过骨关节炎影像学Kellgren-Lawrence Grading(KLG)检查再将骨关节炎患者分为骨关节炎早期(KLG < 2)15例，骨关节炎中期(KLG= 2)15例，骨关节炎晚期(KLG > 2)15例。按ARA1987年制定的类风湿关节炎(RA)诊断标准诊断为类风湿关节炎患者10例^[18]，按ARA1977年制定的痛风性关节炎(GA)诊断标准，诊断痛风性关节炎患者10例^[19]。试验过程中招募健康志愿者10例。排除标准：膝关节有明确外伤史、手术史、恶液质、类固醇注射史、肿瘤史、感染史。

经患者或健康志愿者知情同意后，经关节腔穿刺抽取关节液置于无菌、无酶的冻存管，保存于液氮中。试验经医院伦理委员会审批通过，

1.4 材料 高速冷冻离心机购自美国热电公司；各种量程移液器购自德国Eppendorf公司；吸头、EP管、冻存管、PCR管购自美国Axygen公司；SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司；实时荧光定量PCR仪购自ABI公司(型号：PRISM^® 7500 Sequence Detection System)；Trizol溶液购自Invitrogen公司；dNTP、RNase inhibitor、M-MLV购自Promega公司。

1.5 方法

1.5.1 总RNA抽提取300 μL关节液，加入4倍体积Trizol溶液，再加入200 μL氯仿，强烈振荡20 s后静置 3 min；使用珠海黑马TGL-16R高速冷冻离心机 10 000×g离心15 min；小心将上层水层移至另一个新的无RNase的EP管中；加入10 μL SiO₂吸附液，混匀， 8 000×g离心1 min；吸弃上清，加入体积分数为75%乙醇400 μL，8 000×g离心1 min；吸弃上清，风干15 min，加入30 μL DEPC水溶解RNA。

1.5.2 反转录采用茎环法进行反转录，取10 μL总RNA置于无RNase的PCR管中混匀，85 ℃孵育5 min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；在另一去RNase的PCR管中配置含10 mmol/L dNTP 2.0 µL，RNase inhibitor 0.5 µL，miR-140-3p反转录引物0.5 µL，miR-140-5p反转录引物0.5 µL，U6反转录引物0.5 µL，5× buffer 4.0 µL，M-MLV 0.5 µL，DEPC水1.5 µL的溶液，将配置好的溶液加入至上述含10 µL总RNA的PCR管中，混匀后42 ℃孵育60 min，然后85℃孵育10 min灭活反转录酶。

1.5.3 定量PCR 检测序列片段大小：内参片段U6为94 bp，目的片段 hsa-miR-140-3p为71 bp (MIMAT0004597)，见表1。PCR反应总体积为20 µL，其中cDNA(1︰20)5.0 µL，上游引物0.5 µL，下游引物0.5 µL，2×SYBR Green qPCR SuperMix 10 µL，dH₂O 4.0 µL。反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s读板，40个循环，熔解曲线分析：温度60-95 ℃，每个样重复3次。

1.6 主要观察指标 miR-140-3p在各组膝关节液中的相对表达量。

1.7 统计学分析 所获得的数据均采用SPSS13.0软件进行处理，膝关节液中miR-140-3p的相对表达量应用2^-??Ct进行统计学分析^[20]，若资料满足方差齐性，采用单因素方差分析或多组间多重比较分析法，若方差不齐，则采用Tamhane’s T2检验进行组间比较分析。骨关节炎严重程度与miR-140-3p表达量之间的相关性采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。

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讨论

膝关节骨关节炎是一种以关节软骨退行性变和关节周围骨质增生为病理性特征的慢性进行性骨关节病，相关危险因素研究一直是国内外众多专家关注的热点^[21-23]，其中年龄是膝骨关节炎进展强有力的预警信号已得到充分认可，骨关节炎与年龄关系密切，随着年龄增长骨关节炎检出率呈增高趋势^[24]。通过分析45例骨关节炎患者的年龄特征也可以发现，随着骨关节炎严重程度的增加，年龄呈不断增高的趋势，这就进一步验证了年龄增加在骨关节炎发展进程中的重要作用。有研究显示，年龄的变化将对miRNA的表达产生一定影响^[25]，在小鼠年龄增长的过程中，肝组织中的miRNA呈上调趋势比下调趋势明显，在小鼠心脏衰老的过程中心脏成纤维细胞和上皮细胞中miR-22的表达呈上调趋势^[26-27]。尽管目前已有部分研究表明年龄与miRNA表达之间具有一定相关性^[28]，但是机体受环境因素、遗传因素以及疾病复杂性等的影响，年龄与miRNA表达的具体相关性仍未明确^[25]。通过分析年龄与miR-140在健康对照组及骨关节炎各组关节液中表达情况，结果可以发现，miR-140-3p在膝关节液中相对表达量与年龄之间无直线相关性。因此可以认为miR-140-3p在骨关节炎不同分期患者关节液中表达的差异性并不是由于年龄因素引起的。

miRNA是广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，其不编码蛋白质，但可在转录后调控基因表达，影响蛋白质的翻译，参与机体各种重要的生理和病理过程。大量miRNA在各种生物体内被发现，其中哺乳动物体内的mRNA有将近1/3被miRNA所调控^[29]。随着科学界对microRNA在调控细胞功能方面的研究日渐加深，以及新的microRNA作用靶标的发现，越来越多的研究证明，microRNA可在多方面调控骨关节炎软骨相关基因的表达^[29-30]。miR-140是在正常软骨中特异性表达的少数几个microRNA 之一，miR-140在斑马鱼、小鼠等动物的关节软骨中显示出特异性高表达^[31-33]。定向敲除小鼠体内miR-140基因后，小鼠表现出与骨关节炎类似的病理过程，表现出软骨蛋白多糖的减少和关节软骨的纤维化，小鼠在12个月时甚至出现严重软骨缺损，但在关节软骨中过表达miR-140的转基因小鼠具有一定的抵抗骨关节炎发生的效应^[5]，这就表明miR-140在调节软骨生长和稳态过程中发挥至关重要的作用。Miyaki等^[34]通过实时定量PCR检测19例骨关节炎患者膝关节软骨标本中miR-140基因的表达，证实骨关节炎患者关节软骨组织中miR-140基因的表达明显低于正常关节软骨。因此，miR-140是骨关节炎发病过程中的重要调控基因，关节软骨中miR-140表达的变化可能是骨关节炎进展的重要预警信号。

miR-140由MiR-140-3p与-5p组成，二者均位于编码E3泛素连接酶WWP2基因的内含子中，在内含子被剪切的过程中被导出^[35]。以往研究中均选取miR-140-5p作为研究对象探讨miR-140在软骨细胞及软骨组织中的作用^[36]。但新近的研究却发现，在骨关节炎软骨细胞中miR-140-3p的表达较对照组明显下调^[13]，并且对众多miRNA进行检测后发现在成软骨分化的骨髓间充质干细胞和未分化的软骨细胞中miR-140-3p和miR-140-5p均处于明显的高表达水平^[14]。试验通过荧光定量PCR检测健康志愿者、类风湿关节炎、痛风性关节炎及骨关节炎患者膝关节液中均有miR-140-3p表达，骨关节炎组膝关节液中miR-140-3p的表达量为非骨关节炎组的9.6倍，并且骨关节炎患者膝关节液中miR-140-3p的表达量随骨关节炎严重程度的增加呈相对降低的趋势，这就说明不仅miR-140-5p在骨关节炎病理过程具有重要调控作用，miR-140-3p也可能是骨关节炎病程进展的重要调控基因。在类风湿关节炎及痛风性关节炎患者膝关节液中miR-140-3p的表达量虽较正常对照稍有减低，但差异无显著性意义，这可能是由于纳入的类风湿关节炎和痛风性关节炎患者膝关节病变软骨受累较轻的原因造成的。

组织中miRNA不仅可以作为关键分子在细胞内调控相关基因表达，同时也可以作为生物标志物反映机体各种病理状况^[37]。关节滑液中的miRNA也可以用于分析骨关节炎病理过程，并且对骨关节炎具有潜在的诊断价值^[38]。miR-140-3p在骨关节炎患者关节液中表达明显下调，并与骨关节炎严重程度呈负相关，因此骨关节炎患者关节液中miR-140-3p的表达情况可以在一定程度上反映骨关节炎病程的进展。若经过进一步的大样本量化分析，miR-140-3p将有望成为早期诊断骨关节炎的候选生物标志物，为骨关节炎早期诊治提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

膝骨关节炎患者关节液中miR-140-3p表达可反映骨关节炎进程

Expression of miR-140-3p in synovial fluid of knee osteoarthritis patients reflects the progression of osteoarthritis

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